Kriminalistika čtvrtletník pro kriminalistickou teorii a praxi |
ročník XXXV2/2002 |
S nástupem metod umožňujících cíleně pracovat přímo s konkrétními úseky na molekulách DNA se pro forenzní zkoumání otevřela cesta k využití biologické individuality každého lidského jedince k jeho individuální identifikaci podle kriminalistických stop.
Historie metod kriminalistického využití analýzy DNA k identifikaci začala metodou tzv. DNA fingerprintingu, která byla poprvé popsána v roce 1985 anglickým genetikem A. Jeffreysem. 1) 2)
Princip spočívá ve využití úseků DNA, v nichž se opakují shodné sekvence (pořadí) nukleotidů. Tyto úseky jsou pak enzymaticky v určitých cílových místech, odpovídajících použitému enzymu, rozštěpeny restrikčním enzymem. Tak dojde ke vzniku směsi různě dlouhých fragmentů DNA. Po elektroforetickém rozdělení těchto fragmentů podle velikosti se na řádky fragmentů aplikuje tzv. multilokusová sonda (krátký sled nukleotidů, který se připojí vždy k těm fragmentům, které obsahují odpovídající doplňkové nukleotidy). Použitá sonda bývá ke zviditelnění označena radioizotopem nebo navázanou peroxidázou. Popsaná metoda genetické analýzy DNA bývá nazývána „restriction fragment length polymorphism - RFLP“. Jistě si vzpomenete na fotografie dlouhých sloupců různě intenzivně zbarvených skvrn a proužků. Popsané elfogramy z konce 80. let jako první umožnily individuální identifikaci osob na základě analýzy DNA. Tato metoda byla nejen časově náročná a pracná, ale hlavně měla vysoké riziko ovlivnění výsledku v závislosti na degradaci zkoumané DNA, vyvolané sekundárním působením na stopu nebo metodickým detailem ve zpracování analýzy (foto č. 1).
V devadesátých letech se proto začaly využívat detekční proužky s navázanými DNA sondami.3) V případě hybridizace amplifikovaného úseku DNA (tj. spojení navázané sondy s odpovídající alelou ve vyšetřovaných lokusech) a následné enzymatické detekce se příslušná místa výrazně zabarvovala. Podle zbarvených skvrn v označených místech na detekčních proužcích bývají nazývány DOT-BLOT metody. Jejich hlavním nedostatkem však je to, že nedosahují vylučovacích kritérií, která lze označit za individuální (foto č. 2).
Od devadesátých let se pro identifikační forenzní zkoumání ustálila v celém světě prakticky jediná metoda - stanovení tzv. STR polymorfizmů.4) 5) 6) Metoda využívá variabilitu v opakování krátkých sekvencí nukleotidů v určitých úsecích DNA (STR - Short Tandem Repeat). Aby bylo dosaženo vysoké rozlišovací schopnosti, je vyšetřováno těchto STR polymorfizmů více současně. Po současné amplifikaci více úseků DNA s vyšetřovanými polymorfizmy jsou získané amplifikáty rozděleny podle velikosti a hodnoceny v tzv. sekvenátoru, v našem případě na přístroji firmy PE Applied Biosystems ABI PRISM 310 (foto č. 3 a 4 7).
V genetických laboratořích Policie ČR jsou z technických i finančních důvodů využívány diagnostické sady Power Plex 16 firmy Promega, které obsahují všechny potřebné komponenty k současnému vyšetření 16 polymorfizmů včetně amelogeninového systému určujícího pohlaví osoby, od které pochází vyšetřovaný materiál. Při stanovení všech 16 polymorfizmů lze dosáhnout pravděpodobnosti shody dvou nepříbuzných jedinců v populaci asi 1:1018. Žádný ze stanovovaných STR polymorfizmů (s výjimkou amelogeninového lokusu) nekóduje významný somatický znak nebo vrozenou vlastnost jedince, a tedy ani není využíván při lékařské diagnostice chorob.
Tak jako se postupem času ustálila metoda forenzní genetické analýzy, sjednotily se i polymorfizmy používané k vytvoření DNA - profilu, tj. určitého vzorce, který je charakteristický pro každého lidského jedince. Jedná se asi o 20 polymorfizmů, podle typů používaných analytických sad. Ke všem používaným STR polymorfizmům byly zpracovány populační studie pro určité typy populací a stanoveny frekvence výskytu jednotlivých alel.
Z výsledku genetické analýzy je možné podle populační frekvence zjištěných alel spočítat pravděpodobnost četnosti výskytu zjištěného DNA profilu v populaci. K dosažení pravděpodobnosti, kterou lze považovat za individuální identifikaci jednotlivce, v praxi většinou stačí stanovení asi 9 - 12 polymorfizmů STR lokusů. Chybí však jednoznačné stanovisko, které by podobně jako v daktyloskopii stanovilo hranici pravděpodobnosti četnosti výskytu určitého profilu jako dostačující k individuální identifikaci.
Jako rutinně geneticky zpracovatelné biologické stopy označujeme ty materiály lidského původu, ve kterých zůstalo zachováno buněčné jádro. Nejčastěji se jedná o krevní stopy, kde se využívá DNA izolovaná z leukocytů a uvolněných buněk tkání krevního oběhu. Dále se využívají stopy slin s uvolněnými epiteliálními buňkami z ústní dutiny, epiteliální buňky uvolněné z pokožky na místech kontaktu, buňky zachycené na koříncích vlasů, spermie nebo uvolněné buňky v tělních sekretech.
Jako srovnávací materiály osob se odebírají zejména stěry z ústní sliznice (bukální stěry). K tomu se využívají sterilní vatové tampony, které v žádném případě neohrožují zdraví ani důstojnost osoby, které je stěr odebírán. Pro tyto účely jsou připraveny odběrové soupravy, které obsahují návod a vše potřebné k provedení odběru a zabezpečení vzorku (foto č. 5 a 6).
Není-li možno odebrat srovnávací vzorek od určité osoby, lze provést identifikaci genetickým vyšetřením nejbližších přímých příbuzných, ať rodičů, nebo potomků. Tento postup se používá např. při identifikaci neznámých mrtvol.
Často bývá diskutováno zpracování materiálu zvířecího původu. Po vyizolování DNA nedochází při PCR reakci k navázání primerů, a tedy ani k amplifikaci zkoumaných úseků DNA. Takový vzorek nelze vyhodnotit. Molekulárně genetické vyšetření jiného než lidského biologického materiálu se v laboratořích Policie České republiky neprovádí a dožadující orgány jsou v případě potřeby odkazovány na civilní pracoviště zabývající se veterinární genetikou.
Po zajištění biologické stopy je prvním metodickým úkonem izolace jaderné DNA. Podle typu stopy, stavu materiálu a dalších plánovaných úkonů je nutno zvolit vhodný izolační postup. 7) 8) Základní metodou je fenol-chloroformová extrakce, kdy po narušení buněčných membrán v prostředí inaktivujícím lytické pochody jsou enzymem proteinázou K uvolněny nukleové kyseliny z bílkovinných obalů. Ve směsi fenol/chloroform jsou potom odděleny nukleové kyseliny od bílkoviny. Podle potřeby může následovat pročištění nukleové kyseliny vysrážením a promytím v alkoholu nebo zakoncentrováním pomocí koncentrátorů Centricon 100. Tato metoda je časově náročná, ale umožňuje získat velmi čistou vysokomolekulární frakci DNA.
Další dvě metody izolace jaderné DNA, chelexová extrakce a extrakce pomocí FTATM papírků, jsou maximálně zjednodušené, aby snadným a rychlým způsobem připravily DNA pro amplifikační reakci (PCR). Při chelexové metodě jsou vysokou teplotou narušeny buněčné membrány a bílkoviny a přidávaná látka Chelex vyvazuje polyvalentní ionty kovů, aby inaktivovala lytické procesy.
Používané FTATM papírky byly vyvinuty pro skladování biologických materiálů před genetickým vyšetřením. Papírky jsou napuštěny látkami, které chrání molekuly DNA před nukleázovou a bakteriální degradací. DNA navázaná na celulózovou složku FTA papírků vydrží stabilní při pokojové teplotě několik let. Z papírku s biologickým materiálem jsou vyráženy terčíky o průměru asi 2 mm, z kterých jsou extrahovány buněčné komponenty kromě DNA, která zůstává navázána na terčík. Propraný terčík s navázanou DNA se použije pro amplifikační reakce.
K oddělení DNA z epiteliálních a spermatických buněk byla vypracována tzv. metoda diferenciální extrakce. Využívá se dvou následných extrakcí, kdy při první (s SDS a proteinázou K) jsou narušeny epiteliální buňky, epiteliální frakce je odebrána a teprve v druhém extrakčním roztoku (s SDS, proteinázou K a dithiothreitolem - DTT) jsou rozbity spermatické buňky s odolnější buněčnou membránou, a lze je tedy samostatně analyzovat.
Po izolaci DNA je vhodné zvláště u nestandardních vzorků stanovit množství izolované DNA. Důvodem je skutečnost, že používané amplifikační sety pracují optimálně ve velmi úzkém rozmezí množství DNA, které je asi 1,0 - 2,5 ng templátové DNA ve vzorku. Méně, ale i více DNA způsobí, že při PCR nedochází k řádnému namnožení požadovaných úseků DNA.
Namnožení probíhá zcela jedinečnou metodou, polymerázovou řetězovou reakcí (The Polymerase Chain Reaction - PCR, amplifikace DNA). Určité úseky na izolované DNA jsou namnoženy (amplifikovány) do takového množství, které je potřebné pro provedení analýzy. Proces probíhá cyklicky a jednotlivé fáze jsou řízeny změnou teploty, proto se používané zařízení nazývá termocykler. V kriminalistice jde snad o jedinou metodu, kterou lze namnožit analyzovaný materiál stopy a která navíc vede k individuální identifikaci. Tato skutečnost je však zároveň důvodem pro přísná opatření, aby nemohlo dojít ke kontaminaci vzorku nežádoucí DNA.
K izolované DNA se přidá směs látek amplifikačního setu obsahující primery (úseky nasyntetizované DNA, které přesně určují místa startu a ukončení množení úseku templátové DNA s vyšetřovanou alelou), „stavební kameny“ (nukleosid trifosfáty) a enzym, který spojuje jednotlivé nukleotidy (DNA polymerázu). Používané sety (v našem případě Power Plex 16 firmy Promega) obsahují několik sad primerů, které umožní současné množení několika požadovaných úseků DNA se sledovanými alelami. V případě sady Power Plex 16 se současně amplifikuje 2 x 16 úseků DNA, které obsahují alely 16 sledovaných polymorfizmů. Pro usnadnění dalšího vyhodnocení je vzniklý produkt (fragmenty amplifikované DNA) označen fluorescenčními barvivy.
Výsledkem PCR je tedy směs 2 x 16 úseků DNA (každá tělní buňka lidského jedince obsahuje 2 genetické výbavy DNA, které se mohou v některých alelách lišit). Stanovované polymorfizmy v sadě musí být určeny tak, aby se jednotlivé úseky DNA lišily svou délkou a při následné analýze se navzájem nepřekrývaly. Celkový objem směsi, ve které probíhá amplifikace, je asi 20 - 50 µl.
Následuje analytická část metody, kdy je nutno stanovit alely, které nesou jednotlivé namnožené úseky DNA. Jednou z dříve užívaných metod je výše zmiňovaná DOT-BLOT metoda. Její princip spočívá v tom, že tzv. sondy, úseky DNA, které jsou složeny ze sekvence nukleotidů odpovídající určité alele a s touto alelou hybridizují, tj. spojují se ve dvoušroubovici, jsou navázány na označená místa v proužku. Obsahuje-li amplifikát odpovídající alelu, dojde ke spojení se sondou a barevné indikaci.
Všeobecně používané STR metody využívají tzv. délkové polymorfizmy, tj. jednotlivé alely určitého lokusu DNA, které se liší délkou namnoženého úseku, tj. počtem opakování určité krátké sekvence nukleotidů. Namnožené úseky DNA v amplifikátu je nutno elektroforeticky rozdělit podle délky buď gelovou, nebo kapilární elektroforézou. V genetických laboratořích Policie ČR jsou využívány přístroje ABI PRISM 310 (obecně nazývané sekvenátor) s jednou kapilárou. Po rozdělení úseků DNA podle velikosti prochází médium s úseky laserovým detektorem a je graficky zaznamenána absorbce monochromatického světla. Ke kalibraci délky úseku, která je charakteristikou určité alely, je v sadě přidán vnitřní velikostní standard, tzv. ladder (žebřík), což je směs velikostně přesně definovaných úseků DNA k porovnávání a kalibraci délky.
Výsledkem forenzní genetické analýzy je stanovení tzv. DNA profilu. Jedná se o určení alel v analyzovaných DNA polymorfizmech (foto č. 7). Tento DNA profil slouží jako mezinárodní znak identifikující lidského jedince.
Podle stavu materiálu není vždy možné stanovit všech 16 polymorfizmů. Stabilita DNA polymorfizmů je většinou závislá na délce stanovované alely. Obecně lze říci, že s klesající délkou roste její odolnost vůči nepříznivým vlivům. Amelogeninový systém s krátkým úsekem DNA bývá nejodolnější při degradaci. Může se tedy stát, že forenzním molekulárně genetickým vyšetřením bude stanoveno pouze, že se jedná o biologický materiál muže či ženy a že další polymorfizmy, a tedy DNA profil, nebylo možné pro degradaci materiálu stanovit.
V praxi se běžně vyskytuje v jedné stopě DNA materiál více než jedné osoby. V případě smísených biologických stop se to projeví při hodnocení některých DNA polymorfizmů zjištěním více než 2 alel. Při nerovném zastoupení složek ve smísené stopě je příměs stanovitelná nad 15 - 20 %. Může se proto stát, že složka s minoritním podílem pod uvedenou mez nebude prokázána.
Molekulárně genetickou analýzou se hodnotí lidská jaderná DNA většinou bez ohledu na typ buněk či tkáně, z nichž pochází. Je-li nutno hodnotit druh tkáně, buněk nebo sekretu, je nutné použít klasické analýzy.
V případě maximálně zdegradovaného materiálu, kdy není možné stanovit polymorfizmy jaderné DNA, lze využít analýzy mitochondriální DNA (mt DNA), jejíž molekula je stabilnější. V tomto případě se provádí sekvenční analýza krátkých hypervaribilních úseků mt DNA. Výsledek je možno pouze interpretovat jako porovnání shody vyšetřovaných vzorků v rámci dané linie. Nejedná se však o výsledek kompatibilní s DNA profilem stanoveným z jaderné DNA. Další zvláštností mitochondriální DNA je její matroklinní dědičnost, tzn. mitochondrie se mezi generacemi předávají pouze ve vajíčku a nikoli ve spermii. To se projeví tak, že zjištěná sekvence nukleotidů úseku mitochondriální DNA se předává pouze od matky bez ohledu na otce.
Zápis DNA profilu, tzn. alfanumerický sled dat, nabízí možnost databázového zpracování. V posledních letech se proto začaly v jednotlivých státech budovat národní DNA databáze. 9) 10) V Evropě jako první v roce 1995 úspěšně zavedla genetickou databázi Velká Británie, která má v současné době přes jeden milion uložených DNA profilů a vzorků osob. Ostatní evropské státy většinou zavedly databázi mezi léty 1998 a 2000. Vzhledem k celosvětovému sjednocení metodik a alfanumerické povaze DNA profilu většinou nejsou se zaváděním databáze technické a odborné problémy. Navíc FBI poskytuje za přijatelných podmínek policejním institucím svůj zavedený program CODIS (The Combined DNA Indexing System) pro uchovávání a vyhledávání DNA profilů. K přijetí tohoto programu se přiklání stále více států, dokonce i ty, které již začínaly s vlastním programem.
Největší a často těžko překonatelné problémy, které omezují efektivnost DNA databáze, jsou zdá se v současné době s legislativními podmínkami. Zatímco některé státy, např. Velká Británie, za pomoci masivní kampaně přesvědčují o výhodách uložení genetického materiálu všech občanů v národní databázi, jiné státy, např. Francie, mohou ukládat do databáze pouze pachatele násilné sexuální trestné činnosti. Naše zákonná norma (tzv. euronovela zákona o policii, zákon č. 60/2001 Sb. ze dne 11. ledna 2001, kterým se mění zákon č. 283/1991 Sb., o Policii České republiky) umožňuje odebírat osobám obviněným z trestné činnosti biologický materiál a ukládat do databáze (viz § 42e, 42g zákona o Policii ČR).
Druhou částí legislativního zabezpečení DNA databáze jsou podmínky vyřazení deponovaných položek jak v informační, tak i ve fyzické části národní DNA databáze. Opět existují veliké rozdíly mezi zákonnými normami jednotlivých států.
V České republice po technické i legislativní stránce probíhá příprava na převzetí programu CODIS od FBI a provozování DNA databáze v Kriminalistickém ústavu Praha. V průběhu roku 2002 budou vypracovány všechny podmínky provozování databáze, tj. technické, odborné i bezpečnostní, a bude vypracován provozní řád. V dalších letech může být systém rozšířen o další regionální databázové terminály.
Z výše uvedených údajů vyplývá, že z forenzní genetické expertizy se stal univerzální nástroj vyšetřování trestné činnosti s analogickými možnostmi, jakými disponuje daktyloskopická expertiza včetně ukládání a automatizovaného vyhledávání stop a relevantních osob. Každá biologická stopa může být porovnána se sbírkou stop z míst činu a osob obviněných z trestné činnosti.
Článek informuje čtenáře o současných forenzních genetických metodách používaných v kriminalistickotechnických laboratořích Policie ČR. Dále se zmiňuje o souvisejících aspektech, jako je historický vývoj, zpracovávaný materiál, izolace DNA a vedení DNA databáze. Účelem článku není podrobný popis metod, ale všeobecné seznámení s celou problematikou molekulárně genetických expertiz.
This article informs readers about forensic genetic methods presently used in technical criminological laboratories of the Czech Police. It also mentions some related aspects, such as historical development, the examined material, DNA isolation, and keeping a DNA database. This article does not aim at a detailed description of methods, but at a general introduction of the entire issue of molecular genetic expertise.
Der Artikel informiert die Leser über die jetzigen forensischgenetischen Methoden, die in den kriminalistisch-technischen Laboratorien der Polizei angewendet werden. Weiter erwähnt er die verbundenen Aspekten, wie z. B. die historische Entwicklung, das bearbeitete Material, die Isolation der DNS und die Führung der DNS Datenbasis sind. Zweck des Artikels ist keine ausführliche Beschreibung der Methode, sondern allgemeines Bekanntwerden mit der ganzen Problematik der molekulargenetischen Expertisen.
1) Jeffreys, J. A. - Wilson, V. - Thein, S. L., et al.: Individual specific „fingerprints“ of human DNA. Nature, 1985, 316, s. 76 - 79.
2) Gill, P. - Jeffreys, J. A. - Werrett, D. J.: Forensic application of DNA fingerprints. Nature, 1985, 318, s. 577 - 579.
3) Erlich, H. A.: HLA DQ alpha typing of forensic specimens. Forensic Science International, 1992, 53 (2), s. 227 - 228.
4) Fregeau, C. J. - Fourney, R. M.: DNA typing with fluorescently tagged short tandem repeats: a sensitive and acurate approach to human identification. Biotechniques, 1993, 15 (1), s. 100 - 119.
5) Gill, P. - Kimpton, C. P. - Urquhart, A. - Oldroyd, N. - Millican, E. S. - Watson, S. K. - Downes, T. J.: Automated short tandem repeat (STR) analysis in forensic casework - a strategy for the future. Electrophoresis, 1995, 16 (9), s. 1543 - 1552.
6) Lygo, J. E. - Johnson P. E. - Holdaway, D. J. - Woodroffe, S. - Whitaker, J. P. - Clayton, T. M. - Kimpton, C. P. - Gill, P.: The validation of short tandem repeat (STR) loci for use in forensic casework. International Journal of Legal Medicine, 1994, 107 (2), s. 77 - 89.
7) Butler, J. M.: Forensic DNA typing. London, Academic Press, 2000.
8) Inman, K. - Rudin, N.: An introduction to forensic DNA analysis. New York, CRC Press Inc., Boca Raton, 1997.
9) Schneider, P. M. - Martin, P. D.: Criminal DNA databases: the European situation. Forensic Science International, 2001, 119, s. 232 - 238.
10) DNA databáze. Odborná sdělení Kriminalistického ústavu, 1999, 4, částka speciál.